Produzione di progenitori telencefalici ventrali e neuroni striatali tramite sovra-espressione inducibile di fattori di trascrizione in cellule staminali embrionali umane

Le cellule staminali possiedono due caratteristiche distintive fondamentali: autorinnovamento e potenziale differenziativo. Quello che rende le linee cellulari di staminali embrionali umane (hES) estremamente interessanti per la ricerca è la loro capacità di generare tutte le cellule di un organismo, comprese le staminali tissutali multipotenti, specializzate nella produzione di cellule specifiche per il tessuto o per il sistema di cui fanno parte. In questa tesi abbiamo utilizzato le celule hES per derivare cellule neuroepiteliali di tipo telencefalico ventrale. Queste cellule sono state poi differenziate con successo in neuroni striatali. Per realizzare questo obiettivo ci siamo basati sulle conoscenze di neurobiologia dello sviluppo a nostra disposizione. La neurogenesi nel mammifero ha inizio con l’induzione del neuroectoderma, che forma la placca neurale, la quale si ripiega formando il tubo neurale. Queste strutture sono costituite da cellule chiamate progenitori neuroepiteliali (NEPs). Progressi nel campo delle colture cellulari hanno permesso di studiare questo processo di neuralizzazione, inducendolo in cellule staminali embrionali in vitro. Durante il differenziamento neurale, le cellule hES vanno incontro ad una progressiva restrizione del loro destino, analogamente a quanto avviene in vivo, portando alla generazione di diverse popolazioni di precursori neurali. Il protocollo di differenziamento usato in questa tesi è basato su una doppia inibizione della via di SMAD (dual-SMAD inhibition protocol), grazie alla somministrazione di un inibitore di BMP e di una molecola sintetica, capace di inibire la via di trasduzione del segnale di TGFβ. Queste cellule esprimono marcatori specifici per le "rosette", strutture cellulari che rappresentano la controparte in vitro del tubo neurale. Abbiamo focalizzato l’attenzione sulla formazione del corpo striato che prende origine dalle eminenze ganglioniche laterale (LGE), ed in particolare sulla sua parte ventrale (vLGE), che dà origine ai neuroni striatali (MSN, medium-sized spiny neurons). Per il differenziamento verso un fenotipo striatale sono state adottate due strategie. Una strategia ė basata sul dual-SMAD inhibition protocol e prevede la somministrazione di morfogeni (Shh e Dkk-1), con lo scopo di fornire le coordinate posizionali corrette alle cellule hES durante il loro differenziamento in senso neurale. Una seconda strategia ė basata sulla sovra-espressione inducibile di fattori di trascrizione importanti per lo sviluppo dello striato. In particolare, in questa tesi verranno mostrati i risultati ottenuti con le linee di cellule hES inducibili per Gsx2 e per Ctip2-Ebf1: in quest' ultimo caso i fattori sono co-espressi tramite una sequenza IRES. Lo studio di queste linee ha mostrato come la sovra-espressione inducibile rappresenta uno strumento utilissimo per conferire alle cellule hES un carattere neuroepiteliale prima, e striatale poi. L’espressione a mosaico dei fattori trascrizionali nelle nostre linee stabili inducibili ha permesso da un lato un' analisi più dettagliata del ruolo dei fattori di trascrizione studiati, dall' altro ha evidenziato il bisogno di sviluppare sistemi di sovra-espressione più efficienti per migliorare il processo differenziativo in termini di percentuali di cellule ottenute con fenotipo striatale al termine del differenziamento

Stem Cell-Derived Human Striatal Progenitors Innervate Striatal Targets and Alleviate Sensorimotor Deficit in a Rat Model of Huntington Disease

Huntington disease (HD) is an inherited late-onset neurological disorder characterized by progressive neuronal loss and disruption of cortical and basal ganglia circuits. Cell replacement using human embryonic stem cells may offer the opportunity to repair the damaged circuits and significantly ameliorate disease conditions. Here, we showed that in-vitro-differentiated human striatal progenitors undergo maturation and integrate into host circuits upon intra-striatal transplantation in a rat model of HD. By combining graft-specific immunohistochemistry, rabies virus-mediated synaptic tracing, and ex vivo electrophysiology, we showed that grafts can extend projections to the appropriate target structures, including the globus pallidus, the subthalamic nucleus, and the substantia nigra, and receive synaptic contact from both host and graft cells with 6.6 ± 1.6 inputs cell per transplanted neuron. We have also shown that transplants elicited a significant improvement in sensory-motor tasks up to 2 months post-transplant further supporting the therapeutic potential of this approach

Pre-weaning growth performance of ANGUS and BRANGUS nursing heifers with or without access to artificial shade (11×7.3 m in length and 2.4 m high) during summer (56-d; July to September).

Pre-weaning growth performance of ANGUS and BRANGUS nursing heifers with or without access to artificial shade (11×7.3 m in length and 2.4 m high) during summer (56-d; July to September).</p

Herbage mass, herbage allowance, gain per area, and chemical composition of bahiagrass pastures (1.3 ha/pasture) grazed by pregnant lactating Angus and Brangus cows and their nursing calves with or without access to artificial shade (11 × 7.3 m in length and 2.4 m high) during summer (56-d; July to September).

Herbage mass, herbage allowance, gain per area, and chemical composition of bahiagrass pastures (1.3 ha/pasture) grazed by pregnant lactating Angus and Brangus cows and their nursing calves with or without access to artificial shade (11 × 7.3 m in length and 2.4 m high) during summer (56-d; July to September).</p

Effect of day on plasma concentrations of glucose (<i>P</i> = 0.002; SEM = 2.45) and prolactin (<i>P</i> = 0.02; SEM = 3.41) of ANGUS and BRANGUS multiparous cows grazing bahiagrass pastures with or without access to artificial shade (11× 7.3 m in length and 2.4 m high) for 56-d during summer.

Within day, means without a common superscript (a–b or A-B; glucose and prolactin, respectively) differ (P ≤ 0.05).</p

BREED × SHADE interaction on body weight change, average daily gain, final body weight, and final body condition score of ANGUS and BRANGUS cows and on body weight of their nursing heifers with or without access to artificial shade (11×7.3 m in length and 2.4 m high) during summer (56-d; July to September).

BREED × SHADE interaction on body weight change, average daily gain, final body weight, and final body condition score of ANGUS and BRANGUS cows and on body weight of their nursing heifers with or without access to artificial shade (11×7.3 m in length and 2.4 m high) during summer (56-d; July to September).</p

Effects of SHADE × BREED × day interaction on plasma concentrations of insulin (<i>P =</i> 0.05; SEM = 0.067) of ANGUS and BRANGUS cows grazing bahiagrass pastures with or without access to artificial shade (11× 7.3 m in length and 2.4 m high) for 56-d during summer.

Means without a common superscript (a–e) differ (P ≤ 0.05) or tend to differ (0.05 ≥ P ≤ 0.10), whereas no significant differences are represented by “ns” (P ≥ 0.10).</p

Effect of day (<i>P</i> < 0.001; SEM = 2.458) on plasma haptoglobin concentrations during weaning of beef heifers.

For 56-d prior to weaning, heifers grazed bahiagrass pastures with or without access to artificial shade (11× 7.3 m in length and 2.4 m high). Within day, means without a common superscript (a–d) differ (P ≤ 0.05).</p

Effects of SHADE × BREED × hour interaction on vaginal temperature (<i>P</i> < 0.001; SEM = 0.39) of ANGUS and BRANGUS cows grazing bahiagrass pastures with or without access to artificial shade (11× 7.3 m in length and 2.4 m high) for 56-d during summer.

Data was recorded every 30 min from d 14 to 28 (July 16–30, 2019) of the experiment. There was no difference among SHADE within hours when individual mean comparisons were evaluated (P > 0.11). There was, however, an effect of hour of the day on vaginal temperature (P < 0.001).</p